Разновидности и особенности светящихся флуоресцентных красок

Е. О. Пучков, доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

«Химия и жизнь» №9, 2014

Сразу две статьи этого номера «Химии и жизни» рассказывают о свечении биообъектов. На фото слева — малощетинковый червь Fridericia heliota

, открытый учеными из Красноярского университета. О том, как был исследован его люциферин — вещество, которое при окислении ферментом люциферазой испускает голубоватый свет, — читайте в статье «Огоньки под ногами». На фото справа — синтетический люциферин фридериции в присутствии АТФ и других необходимых компонентов демонстрирует такое же свечение, как и белковый экстракт червя. Это подтверждает, что структура люциферина установлена верно.

В статье «Флуоресцентные репортеры и их репортажи» рассказывается о возможностях, которые предоставляет ученым флуоресценция, свечение вещества, индуцированное светом с меньшей длиной волны. Биомолекулы, несущие флуоресцентные метки-репортеры, — это не только информативно, но и красиво. Лучшее тому подтверждение — микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World: а

— фибробласты мыши,
б
— веслоногий рачок
Temora longicornis
;
в
— митоз в клетках легких тритона;
г
— клетки глии мозжечка мыши
in vivo
(двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

Пример «неживой» флуоресценции — коллоидные растворы квантовых точек разного размера. Квантовые точки — полупроводниковые кристаллы нанометровых размеров. Электроны в них могут совершать квантованные энергетические переходы, причем энергия переходов (а значит, и длина волны флуоресценции, или ее цвет) зависит от размера кристалла.

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы. С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться: пока наметились лишь некоторые перспективы в связи с изучением темной материи и темной энергии. А вот свет человечество давно изучает и использует, в том числе и как исследовательский инструмент.

В последние тридцать лет стремительно растет число методов исследования, основанных на регистрации флуоресценции, и они все шире применяются в биологии и медицине. Обусловлено это как развитием техники, в первую очередь компьютеров и лазеров, так и появлением широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов, так называемых флуоресцентных репортеров. Флуоресцентная методология благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так и в прикладных работах — в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике… Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию из глубин микромира можно получить с их помощью? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего — что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом диапазоне. Давно было замечено, что растворы некоторых органических соединений и минералов изменяют цвет, если наблюдать их не на просвет, а под углом к проходящему свету. Так, например, шотландский натуралист Дэвид Брюстер в 1833 году заметил, что от зеленого спиртового раствора хлорофилла при освещении белым светом «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, знаменитый астроном и физик Джон Гершель описал появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году математик и физик Джордж Стокс обнаружил видимое глазом свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. «В честь» флуорита он назвал это явление флуоресценцией, по аналогии с термином «опалесценция», описывающим явление дихроизма в опале. (Опалесценция — это разновидность дихроизма: рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией. Хотя опалы тоже выглядят желтоватыми в проходящем свете и голубоватыми — в рассеянном, перпендикулярном к проходящему, это не флуоресценция.)

Флуоресценция — один из видов люминесценции. Этим термином описывают все виды излучения, вызванного возбуждением молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хемилюминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют биолюминесценцией. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электролюминесценция), быстрыми электронами (катодолюминесценция), Y-излучением (радиолюминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фотолюминесценции.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами

, или
флуорохромами
. Иногда флуорохромами называют все виды флуоресцирующих молекул, а флуорофорами — только флуоресцирующие компоненты (группировки) крупной молекулы. Однако дальше мы будем использовать термин «флуорофор» для всех типов флуоресцирующих веществ. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть
флуоресцентной меткой
, а свободный флуорофор —
зондом
. Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют
флуоресцентными красителями
. Наконец, флуорофоры, используемые в биологических исследованиях, некоторые авторы стали называть
биосенсорами
. Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году и которая носит его имя (рис. 1).

Принцип работы материала

Флуоресцентные краски относятся к светящимся. Это декоративный лакокрасочный материал, который особым образом реагирует на свет. Под воздействием светового потока роспись, выполненная такой краской, будет выглядеть намного ярче, хотя изделия, покрытие составом, останутся красивыми при любом освещении. Интенсивность «сочности» цвета в темноте больше примерно на 50 %.

Разнообразие оттенков ЛКМ достаточно большое. Есть обычные белые краски и цветные — голубого, розового, черного, коричневого, синего, желтого и многих других тонов. Средства бывают видимыми и невидимыми (бесцветными). Видимые ЛКМ легко различить при любом освещении, но при попадании лучей солнца рисунок дает более сильное свечение.

Состав краски представлен такими компонентами:

• красители или пигменты (флуорофоры);
• полимерная смола — акрил или полиуретан;
• наполнители;
• связующие добавки.

Флуорофор придает материалу уникальные свойства. Вещество делают из родамина, аминонафталимида, цианина и некоторых минералов. Большинство элементов стоят дорого, что обуславливает довольно высокую цену флуоресцентного ЛКМ.

Достоинства средства перекрывают недостатки:

• применять средство можно на улице или рисовать внутри помещения — состав универсален;
• использовать материал легко — для работы достаточно купить кисть или валик, сохнет состав очень быстро;
• кроме декоративных свойств, ЛКМ обладает способностью защищать основание от повреждения, действия влаги;
• расход материала небольшой, за счет чего краска достаточно экономична;
• слой в течение долгого времени не выгорает, не тускнеет, остается красивым;
• материал экологичен — после сушки не наносит вреда природе и человеку.

Как сделать своими руками

Узнав, сколько стоит готовый состав, многие делают флуоресцентный краситель самостоятельно. Для этого приобретают пигмент со светоотражающим эффектом, добавляют порошок в акриловый лак. Флуорофор – это вещество с полимерной основой, приобретают пигмент через интернет или в специализированных магазинах для художников.

Лучше сразу подобрать порошок нужного цвета, чтобы дополнительно не вводить в лак колер.

Флуорофор засыпают в стеклянную или фарфоровую емкость, заливают акриловым лаком, хорошо перемешивают до однородного состава. Отражательная способность краски зависит от количества наполнителя, минимально вводят до 10%, максимально – ½ объема лака. Готовую смесь пред употреблением нужно каждый раз хорошо промешивать, чтобы осевший в осадок, флуорофор поднялся вверх.

Загустевший лак предварительно разводят водой.

Лучше сразу подобрать порошок нужного цвета, чтобы дополнительно не вводить в лак колер.

Применение флуоресцентных ЛКМ

Материал подходит для различных оснований и поверхностей — из дерева, бетона, камня, металла, пластика. Краской можно нарисовать картину на бумаге, картоне, холсте, выполнить печать. При помощи неоновых ЛКМ выполняют тюнинг машин, окрашивают диски авто, дорожные знаки, наносят разметку на дорогу для безопасного движения автомобилей. Краску применяют для стен, отделки полов в кафе, ресторанах, торговых центрах, ночных клубах и даже в квартирах и домах.

Спектр применения материала:

• театральные костюмы, грим;
• мебель — столы, стулья, шкафы;
• различные сувениры и предметы интерьера;
• одежда, обувь — логотипы, различные элементы;
• стекло, керамика, плитка, витражи;
• каменные и бетонные дорожки;
• рамы для окон, элементы беседок;
• велосипеды;
• рисование на теле и лице;
• украшение живых и искусственных цветов;
• маркировка разных обозначений.

При помощи флуоресцентного ЛКМ можно легко декорировать любой предмет своими руками, сделать поделку или подарок, раскрасить стену, фасад дома. Некоторые краски широко применяются для боди-арта — рисования по телу.

Порядок окрашивания

Чтобы покрасить хром-краской рефлектор, сначала обесточьте ваше авто, отсоединив клемму «+» от АКБ. После этого приступайте к работе, а именно:

• после снятия стекла посредством разогрева феном обмотайте его скотчем для предотвращения оцарапывания;
• снимите отражатель и обработайте его сначала крупнозернистой наждачной бумагой. Это позволит удалить всю ее зеркальную поверхность;
• обезжирьте отполированный рефлектор и нанесите на него грунтовочный слой;
• после высыхания грунта (до получаса) нанесите второй его слой. Это обеспечит идеальное выравнивание поверхности;
• после высыхания второго слоя обработайте поверхность мелкозернистой (с размером зерна Р400—Р600) наждачкой, а потом обезжирьте;
• нанесите 2 слоя хром-краски. Первому слою дайте просохнуть 20—30 минут, а второму —до часа.

Покраска отражателей фар авто

Вещество для обеспечения его блеска часто содержит в составе алюминиевую пудру. Поэтому ее нужно часто взбалтывать при работе. Разводить ее растворителем, как многие другие виды красок, не требуется. Наносить можно при помощи краскопульта. При желании в хром-краску добавляются красители для обеспечения хром-эффекта разных цветов. После нанесения некоторые автолюбители покрывают ее лаком. Однако это необязательно, так как при герметичности фар она не будет подвергаться воздействию влаги.

Crafts Spray краска с хром эффектом

Характеристика материала

Некоторые флуоресцентные чернила называют ультрафиолетовыми — из-за способности становиться яркими в темноте. Качественные ЛКМ безопасны для здоровья, но важно оценить их точный состав перед покупкой. Более дешевые средства содержат много фосфора, за счет чего светятся, но токсичны. Покупать подобные материалы не стоит.

Большинство флуоресцентных эмалей содержат УФ-фильтры (модификаторы), которые защищают их от выгорания. Если таких веществ не присутствует, при наружном использовании слой краски скоро поблекнет, ведь начальная светостойкость материала низка. Еще один вариант повысить стойкость к ультрафиолету — нанести сверху на слой краски прозрачный лак с нужными свойствами.

Зернышки пигмента в составе средств всегда довольно крупные, поэтому покрытие будет зернистым. Решить проблему, обеспечив нужную плотность слою, можно путем нанесения в 2 слоя. Почти все флуоресцентные ЛКМ не переносят нагревания выше +150…+200 градусов, поэтому для термически нестабильных поверхностей их применять нельзя.

Самые важные усредненные технические характеристики средств:

• удельный вес — 1,09 – 1,12 кг/л;
• сухой остаток — 50 – 55 %;
• класс опасности — 4 (малоопасные);
• расход — 70 – 90 г/кв.м;
• вязкость по прибору ВЗ/245 — 20 – 40 с.

Лучшие производители готового красителя

В число популярных производителей светящихся лакокрасочных материалов входят:

1. Vesta, предлагающая водостойкие краски, невосприимчивые к воздействию низких температур. Материалы поставляются расфасованными в банки емкостью от 50 мл, заявленный срок службы составляет 50 лет. Эмали серии Professional предназначены для художественных или декоративных работ, имеют хорошую адгезию к бумаге, холсту, металлу и отделочным материалам. Нанесенный на поверхности слой при дневном освещении имеет насыщенный оттенок (по сравнению со стандартными эмалями). Время свечения в темноте составляет до 8 часов.
2. G-Color, выпускающая акриловые фотолюминесцентные краски в аэрозольных баллонах емкостью 250 мл. Материалы излучают видимое в темноте свечение (время работы до 10-12 часов), при использовании ультрафиолетовой подсветки интенсивность увеличивается.
3. Acid Colors, изготавливающая лакокрасочные материалы на основе люминофорных пигментов без фосфора. Производитель заявляет время свечения в темноте 6 часов, после кратковременного облучения лампой накаливания работоспособность восстанавливается. Акриловая база после полимеризации обладает повышенной прочностью и выдерживает воздействие воды. Краски поставляются заказчикам в пластиковых флаконах емкостью 27 мл.
4. Noxton, предлагающая готовые краски и ультрафиолетовые пигменты серии ТАТ-33 (25 оттенков). Серия эмалей Noxton Ultraviolet представлена в 18 стандартных цветах, материалы отличаются устойчивостью к выгоранию. Преимуществом является наличие сертификатов международного образца. Краски поставляются заказчикам на территории Европы, Северной Америки и Ближнего Востока.
5. Proluminofor, поставляющая на рынок сухие пигменты (фасовка по 20 или 100 г либо 1 кг). Материалы отличаются мелким помолом (размер частицы от 5 мкм), производитель заявляет время свечения от 6 до 12 часов. Предлагаются бюджетные порошки на цветной сульфидной основе, выпускаются термостойкие пигменты.

Флуоресцентная акриловая краска Vesta.

Виды флуоресцентной краски

В строительных магазинах реализуется много различных флуоресцентных средств. Огромный выбор наборов представлен в магазинах Леонардо и интернет-центрах для художников. Самые популярные марки — Kudo (Кудо ) в аэрозолях, акриловые аэрозольные краски Bosny, Decola, Paint Glow, различные материалы китайского производства.

Акриловые материалы

Краски на основе акрила наиболее популярны. Благодаря воде в составе это водная дисперсия акрила. Такими средствами работают по бумаге, картону, рисуют картины. Материал безвреден, нетоксичен, имеет слабый запах. Некоторые акриловые краски покупают специально для детских поделок и рукоделия — составы идеальны для выполнения рисунков по коже, дереву. Акрил быстро сохнет, удобен в работе, расход мал.

Для тела

Обычно боди-арт предпочитают подростки, часто посещающие клубы, и люди, ведущие жизнь «тусовщика». В наборах флуоресцентных ЛКМ от 8 цветов и более, их можно смешивать между собой, создавая новые оттенки.

Краски безопасны для кожи, не впитываются, но стоят довольно дорого. Держатся на теле до 18 часов, помогая создать оригинальный образ. Некоторые материалы меняют тон кожи и заметны днем.

Для волос

Популярная флуоресцентная краска, которую можно наносить на волосы, — Manic Panic. Есть три тона средства — синий, красный, желтый. Цвет будет красиво сиять на светлых волосах, а на темных не станет выглядеть столь броско.

Для ткани

При помощи подобных средств разрисовывают одежду (футболки, джинсы) и обувь (кеды, кроссовки). Примером красителя можно назвать JAVANA для ткани. После нанесения изделие придется стирать вручную, иначе принт может испортиться. Краска подходит даже для шелка.

Флуоресцентная эмаль

Эмали используются для интерьерных работ. У них акриловая или полиуретановая основа, цветовая гамма весьма разнообразна. Для создания новых оттенков разные краски смешивают между собой. Интерьерные ЛКМ применяют для оформления красивого дизайна внутри дома, ими работают по штукатурке, гипсокартону, дереву. Для металла и пластика составы подходят, но адгезия будет несколько хуже.

Эмали могут быть предназначены и для наружных работ (для фасадов). В них добавлены специальные компоненты, которые повышают атмосферостойкость, устойчивость к трению, водоотталкивающие качества. Готовое покрытие не нарушает паропроницаемости основного материала. Фасадные краски хорошо подойдут для камня, металла, древесины, бетона, кирпича.

Аэрозольный состав

Обычно краски в баллончиках создаются на акриловой или уретан-алкидной основе. Материалы универсальны, применяются снаружи и внутри помещения. Использовать ЛКМ в баллонах удобно, покрытие будет очень красивым и стойким к действию воды, температуры, солнца.

Порошковая краска

Флуоресцентные порошковые составы применяются для создания дорожной разметки, окрашивания зданий, тюнинга авто, раскрашивания дорожных знаков. Краски наносятся краскопультами. Работать нужно осторожно, с соблюдением мер индивидуальной защиты.

Невидимая краска

У невидимой краски есть одна особенность. Днем покрытие почти незаметно на поверхности, а появляется краска только под действием ультрафиолета или искусственного освещения. На вид практически прозрачна, содержит особые пигменты, реагирующие на свет.

Что это такое

Флуоресцентные краски – специальные составы, которые под действием ультрафиолетового свечения делают любые изображения более объемными и эффектными. Основание покрытия состоит из набора пигментов, которые накапливают и отражают свет. Они связаны между собой клейкой прозрачной основой, которая позволяет зафиксировать состав на поверхности.

Окрашенные флуоресцентной краской поверхности отлично смотрятся в ночное время суток, украшая помещение и создавая особенную атмосферу.

Флуоресцентная краска

Отличие флуоресцентной и люминесцентной красок

Люминесцентная краска тоже относится к группе светящихся ЛКМ. Ее отличие состоит в содержании особых люминофоров, которые обуславливают наличие уникальных свойств. Люминесцентные краски способны поглощать свет из различных источников извне в течение дня, а после начинают сами его излучать.

Чем материал отличается от флуоресцентного, понять несложно. Флуоресцентный ЛКМ днем красивый, яркий, но практически неотличим от простой краски. Люминесцентный светится ночью за счет накопления световой энергии, а днем незаметен. Длительность свечения бывает разной — от нескольких минут до нескольких часов.

Стоят люминесцентные средства дороже, а на их производство требуется особое разрешение. Люминофоры могут работать в течение многих лет, физически и химически стабильны и стойки к действию внешних факторов.

Диаграмма Яблонского

При поглощении фотонов определенной энергии в молекуле флуорофора происходит переход электронов из основного (S0) на один из подуровней возбужденного (S1, S2, … Sn) состояния с более высокой энергией. Спин электрона при переходе не меняется, поэтому данные уровни называют синглетными. Возбужденное состояние нестабильно, и электроны быстро возвращаются на исходный энергетический уровень. Происходить это может несколькими путями. Три из них — безызлучательные квантовые переходы: внутренняя конверсия (уменьшение энергии электрона до минимального синглетного уровня), интеркомбинационная конверсия (уменьшение энергии электронов с изменением спина, с переходом на так называемый триплетный уровень) и вибрационная релаксация (рассеяние поглощенной энергии в виде тепла). Два других сопровождаются излучением света — это флуоресценция и фосфоресценция. Флуоресценция возникает при переходе в основное состояние с нижнего синглетного уровня, а фосфоресценция — с триплетного.

Рис. 1.
Диаграмма Яблонского.Горизонтальные линии
— энергетические уровни электронов: S0 — основное, невозбужденное состояние; S1 — синглетное возбужденное состояние; 0 — 3 — квантованные подуровни; Т1, Т2 — квантованные уровни триплетного возбужденного состояния.
Стрелками
показаны переходы электронов в разные энергетические состояния

Отметим три важных обстоятельства. Во-первых, вероятности переходов, показанных на рис. 1, различаются. О вероятности можно судить по времени, за которое осуществляется каждый из переходов, или по времени пребывания электронов в каждом из этих состояний (см. таблицу): чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция — маловероятные процессы. Вот почему большинство флуорофоров светятся слабо даже при интенсивном облучении. Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в основное состояние только с самого низкого синглетного уровня, энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения. И наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером

, который на языке флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения. Молекулярный репортер, в отличие от газетного репортёра, произносится с ударением на второй слог. Но задачи перед ними стоят сходные: проникнуть туда, куда поручили, и отправить репортаж с места событий.

Времена потенциальных переходов электронов между разными энергетическими состояниями в флуорофорах

Язык флуоресцентных репортеров

Рис. 2.
Спектры поглощения (
пунктир
) и флуоресценции (
сплошные линии
) флуоресцеина и вещества с коммерческим названием Lyso TrackerTM Blue («Molecular Probes»). Изображение с сайта www.lifetechnologies.com

Итак, параметры флуоресценции — язык, с помощью которого флуоресцентный репортер передает информацию. Если продолжить аналогию, то параметры подобно словам приобретают смысл только в контексте, иначе говоря, с учетом условий регистрации. У каждого флуорофора имеется пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

Спектры поглощения и флуоресценции

показывают, свет с какими длинами волн преимущественно поглощает и излучает данное вещество (рис. 2). Основные параметры спектра — интенсивность флуоресценции, положение максимума и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Можно считать, что максимум спектра флуоресценции — это ее цвет, например, если максимум около 540 нм, это означает, что свечение в данных условиях будет зеленым. Оговорка про условия не случайна. Часто именно эти параметры информируют наблюдателя о свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при сдвиге рН среды. Если такие изменения могут быть вызваны только изменениями кислотности и ничем иным, то флуорофор может быть своего рода молекулярным рН-метром — рН-репортером. Характерный пример — Lyso SensorTM Yellow/Blue, чьи спектры показаны на рис. 3.

Рис. 3.

Спектры флуоресценции Lyso SensorTM Yellow/Blue («Molecular Probes») при рН 3 и 9. При изменении кислотности среды меняются и максимум флуоресценции, и общая форма спектра. Изображение с сайта www.lifetechnologies.com

Квантовый выход флуоресценции

— это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно он определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Флуоресцентный репортер часто выбирают именно по этому показателю. Например, флуоресцеин с квантовым выходом около 0,9 (почти единица!) широко применяют как в роли самостоятельного зонда, так и в качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции

— усредненное время, в течение которого молекулы флуорофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов. Измеряют этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень чувствительно к физико-химической «обстановке», в которой находится репортер. С другой стороны, у каждого флуорофора это время свое, что позволяет получать репортажи из одного образца от флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками. Приходя в разное время, сигналы не перекрываются.

Наконец, анизотропия флуоресценции

— количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Но информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. Так, например, существует явление безызлучательной, или резонансной, передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, а у акцептора возрастает. Передача возможна между флуорофорами с определенными спектральными свойствами — и, что особенно важно, находящимися на достаточно близком расстоянии. Это позволяет выявлять взаимодействие молекул и даже оценивать расстояние между ними. Вот почему БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой».

Интересные возможности исследователям предоставляет тушение флуоресценции при физическом взаимодействии флуорофора с молекулами-тушителями, такими, как кислород, галогены, амины, некоторые электрондефицитные органические молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер сообщает о присутствии в его окружении определенных тушителей.

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. Обычно это явление мешает экспериментатору, но в умелых руках может стать специальным методическим приемом. Так, наблюдение за восстановлением флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания дает информацию о вязкости и диффузионных свойств цитоплазмы. В небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, его обесцвечивают кратковременной мощной вспышкой лазера, а затем наблюдают, как флуоресценция восстанавливается за счет диффузии необесцвеченных молекул из других участков клетки.

Какие они, флуоресцентные репортеры?

Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические флуорофоры

наиболее многочисленны и разнообразны. Как велико это разнообразие, можно представить, заглянув в каталог , специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. На момент написания статьи по ссылке было уже одиннадцатое обновление каталога: темпы роста в этой области впечатляют.

У каждого репортера — своя специализация: достоинства и возможности каждого определяют круг задач, для решения которых его применяют. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и соответственно яркую флуоресценцию. Он может быть репортером рН, однако для измерения рН внутри клеток он не подходит, так как не проникает через цитоплазматическую мембрану. Зато мембрану может преодолеть его гидрофобное производное — флуоресцеиндиацетат. Правда, ацетильные группы лишают его возможности флуоресцировать, но внутри клетки их отщепляют ферменты эстеразы. Аналогичным образом (в форме диацетата) доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, который служит для регистрации в клетках активных форм кислорода. Если присоединить к молекуле флуоресцеина изотиоцианатную группу, такой флуорохром будет связываться с аминогруппами нефлуоресцирующих молекул. Таким образом делают флуоресцирующие антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) сам не флуоресцирует, но превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм.

Рис. 4.

Структурные формулы флуоресцеина и некоторых его производных

В 70-х годах ХХ века при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria

были выделены два белка, участвующих в этом процессе. Они всем известны с тех пор, как Нобелевскую премию по химии 2008 года получили их открыватели и создатели исследовательских инструментов на их основе — Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен (см. «Химию и жизнь», 2008, №12), Один из этих белков, экворин, в присутствии ионов кальция окисляет свою простетическую группу, причем возникает хемилюминесценция голубого цвета; второй белок поглощает голубой свет и флуоресцирует зеленым.

Этому второму белку, названному просто green fluorescent protein

(зеленый флуоресцентный белок — GFP, или ЗФБ), суждена была громкая слава. После открытия GFP начались интенсивные исследования его структуры, был клонирован его ген. Оказалось, что этот ген сравнительно несложно экспрессировать в клетках других организмов. Можно также соединить его с геном другого белка и внедрить этот гибридный ген в клетку — тогда она начнет синтезировать белок с флуоресцентной меткой. Позднее у некоторых морских беспозвоночных (кораллов и полипов) обнаружили аналогичные белки с другими спектрами флуоресценции. Методы молекулярной биологии позволили сконструировать гены, кодирующие модифицированные формы флуоресцентных белков с широким диапазоном спектральных характеристик, а также фоторегулируемые варианты, свечение которых можно включать и выключать с помощью ультрафиолетового излучения. Сегодня к услугам исследователей на основе GFP созданы флуоресцентные белки всех цветов радуги, с самыми разнообразными свойствами, и постоянно появляются новые.

Несколько скромнее пока выглядит судьба экворина. Изучение зависимости его хемилюминесценции от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации Ca2+ в некоторых клетках. Для этого существуют и флуоресцентные репортеры, однако хемилюминесцентный метод с использованием экворина не требует облучения, возбуждающего флуоресценцию, которое не всегда безвредно для биологической системы. Экворин относят к сравнительно большой группе люциферинов — веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Они интересны не только с точки зрения их практического применения: ведь до сих пор идут споры о том, зачем биологическим объектам вообще нужна биолюминесценция.

Неорганические флуорофоры

чаще всего используют в составе так называемых биоконъюгатов — комплексов с органическими соединениями или биомолекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее, их ионы, например Tb3+ и Eu3), кластеры из нескольких атомов золота и серебра, в составе таких комплексов приобретают способность к
сенсибилизированной флуоресценции
. Энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важно то, что молекулы — доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе замедленно по сравнению с обычной флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. таблицу 1). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Благодаря этому неорганические био-конъюгаты можно использовать и тогда, когда в исследуемой системе присутствуют другие компоненты, флуоресцирующие в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек — quantum dots

. Как правило, они состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Из-за малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего по 10–50 атомов!) для электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами».) При этом энергия переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, то есть меньше длина волны флуоресценции (см. фото на первой врезке). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек практически с любой спектральной конфигурацией. Добавим, что по сравнению с органическими флуорофорами они обладают более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 5 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), которое покрыто слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющим защитную функцию, и лиганда — какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул. Биоорганическая оболочка обеспечивает стабильность биоконъюгата как коллоидной частицы и формирует задание репортера, его назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую собрать и передать информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (рис. 5). В биоорганическую оболочку включают и низкомолекулярные соединения, такие, как биотин, и высокомолекулярные — одноцепочечные фрагменты ДНК, белки, в том числе ферменты или антитела (IgG).

Рис. 5.

Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан также белок иммуноглобулин G (Ig G) — иначе говоря, молекула-антитело

Как читают флуоресцентные репортажи…

Первым в списке инструментов для получения и анализа сообщений флуоресцентных репортеров был человеческий глаз. Флуоресцентное свечение макроскопических объектов мы наблюдаем непосредственно, а микроскопических — с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примерами макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы флуоресцентные белки, или хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. В обычный флуоресцентный микроскоп (о необычных микроскопах — см. врез ниже), как правило, заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, применяют их и в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток.

Особо отметим эстетическую информативность этих методов. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир разнообразных цветов и форм (см. фото на второй странице обложки). Фирмы- и «Olympus» даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции (работы-победители см. на сайтах The Olympus BioScapes Competition и Nikon’s Small World.

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Их сильная сторона — скорость регистрации сигналов от единичных объектов, например от клеток в суспензии. Обычный коммерчески доступный цитометр работает со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные — до 25 000 клеток в секунду! В стандартном варианте у каждого объекта измеряются от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Таким образом можно получить статистически достоверные результаты по гетерогенности клеточных, в частности микробных, популяций. Существуют также приборы, способные сортировать клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции, чтобы затем изучать субпопуляции с использованием других методов.

…И что из них можно узнать

Итак, все флуоресцентные репортеры имеют специализацию, то есть способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров (как правило, органических флуорофоров) можно следить за ферментативным катализом — исследовать динамику ферментативных реакций, их локализацию в клетках, тканях, органах и т. п. Это, например, субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции, или «профлуорофоры», становящиеся флуоресцентными при взаимодействии с продуктом реакции.

Репортеры, сформированные на основе антител — физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами, — информируют о протекании иммунологических реакций. Флуоресцирующим компонентом может быть любой из известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. Современные технологии позволяют получить антитела к любому белку (антигену), интересующему исследователя, антитело же с флуоресцентной меткой заставит светиться этот белок или структуру, из него построенную. Например, с помощью флуоресцентных антител выявлены микрофибриллы в фибробластах мышей (см. фото на второй странице обложки).

Очень информативны методы с использованием флуоресцентных белков (ФБ). Мы уже упоминали о том, как полезны методы внедрения в клетку генов гибридных белков, которые заставляют флуоресцировать естественный белок или даже нуклеиновую кислоту. Вдобавок флуоресценция ФБ-содержащих гибридных белков зависит от кислотности среды, что позволяет измерять рН не только внутри клетки, но и внутри отдельных органелл, если такой белок «адресован» в ядро или митохондрию.

Особый интерес вызывает применение ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на безызлучательной передаче энергии. Представьте себе два гибридных белка, один из которых заставляет флуоресцировать другой при сближении. Подобным же образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках, если присоединить ФБ к разным участкам одной белковой молекулы.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. В их числе, например, вязкость цитоплазмы, внутреннего содержимого органелл, гидрофобного слоя биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!

Правила и техника нанесения

В зависимости от объема работ нужно приобрести инструменты — кисть, валик или краскопульт. Для поделок нередко применяют ватные тампоны. Краску надо налить в удобную емкость. Небольшое изделие можно покрасить методом погружения. Из баллончика краску просто распыляют на поверхность.

Изделие надо предварительно подготовить: помыть или очистить, высушить. Работы проводят при температуре не менее +10 градусов. Краску размешивают или взбалтывают, выполняют 2 – 3 тонкие слоя. Баллон держат на расстоянии 30 см. Для создания рисунков применяют трафареты, которые были заранее вырезаны. Каждый слой должен сохнуть от 3 часов и более, в зависимости от температуры. Окончательная сушка длится до 24 часов.

Важная роль временного фактора при электростатической окраске

Следует отметить, что временной фактор играет большую роль в обеспечении начальной проводимости окрашиваемых изделий при нанесении всех слоев покрытия. Длительные промежутки между отдельными окрасочными операциями снижают начальную проводимость.